ANGEW | 上海药物所合作发现靶向乙酰化位点的LC3共价小分子探针

  细胞自噬是细胞调控细胞稳态,应对应激条件的重要细胞生命活动[1]。诸多报道表明,细胞自噬与肿瘤、代谢性疾病、免疫失调以及神经退行性疾病等的发生发展有重要的关联[2-5]。然而,现有的自噬调节剂多是直接靶向上游调控蛋白(如mTOR、ULK1),或者调控溶酶体功能(如氯喹),仍然缺乏特异性靶向自噬过程蛋白的小分子探针[6]
  LC3蛋白作为细胞自噬过程中的标志物蛋白,不仅介导了自噬底物招募进入溶酶体降解的过程,还与自噬小体的形成和融合等过程有关。但是,LC3蛋白主要通过蛋白-蛋白相互作用发挥功能,缺乏比较特异的结合口袋。因此,针对自噬核心蛋白LC3开发有效的小分子探针一直是该领域的难题。先前报道中,LC3蛋白的蛋白-蛋白相互作用界面存在多种翻译后修饰(Posttranslational Modification, PTM)(如磷酸化、乙酰化),而位于此界面的翻译后修饰破坏了LC3蛋白与其相互作用蛋白的相互作用能力[7-9]。这为本项研究提出了可能假设,即有无可能靶向这些翻译后修饰位点,实现其化学探针发现?
  在前期研究中,中国科学院上海药物研究所罗成课题组针对翻译后修饰位点的功能调控与化学干预,探索其研究理论方法建立及疾病干预应用:与复旦大学党永军课题组等合作,针对Rho亚家族的磷酸化位点,发现了其全新变构调控口袋,并获得其变构调控小分子化合物DC-Rhoin(Covalent Inhibitors Allosterically Block the Activation of Rho Family Proteins and Suppress Cancer Cell Invasion. Adv Sci. 2020 May 13;7(14):2000098.);与烟台大学赵克浩课题组合作,提出靶向翻译后修饰分型(PTM-isoforms),用于药物发现和疾病分型的可能策略与方法(Drug design targeting active posttranslational modification protein isoforms. Med Res Rev. 2021 May;41(3):1701-1750.);如与苏州大学梁中洁课题组合作,建立基于分子动力学模拟和弹性网络的激酶家族翻译后修饰位点与功能调控数据库,获得靶向Src激酶磷酸化位点的小分子及其复合物晶体结构(Dynamics of Post-Translational Modification Inspires Drug Design in the Kinase Family. J Med Chem. 2021: DOI: 10.1021/acs.jmedchem.1c01076)。这些基于翻译后修饰的化学探针前期探索研究为靶向自噬核心蛋白LC3的小分子探针发现奠定了坚实的基础。
  因此,在该研究中,罗成课题组联合复旦大学/重庆医科大学党永军课题组、上海药物所蒋华良课题组、周兵课题组,利用LC3蛋白质上赖氨酸的反应活性,发现了第一个能共价结合在LC3蛋白乙酰化修饰位点的化学探针。该探针可干预LC3功能的发挥,为自噬调控探针的开发以及相关疾病潜在候选药物开发奠定基础。该研究论文于2021年9月29日在线发表于Angewandte Chemie(“Inhibition of autophagy by a small molecule through covalent modification of LC3”)。
  在该研究中,联合团队分析了LC3B蛋白(LC3家族蛋白中主要的功能蛋白)在蛋白-蛋白相互作用界面上存在翻译后修饰的赖氨酸残基,发现第49位赖氨酸pKa较低,可能存在潜在的共价反应活性。随后,团队针对in house的共价探针小分子库,筛选发现了能够共价结合LC3B K49位的苗头化合物DC-LC3in,其IC50为3.06 μM。
图1. 基于翻译后修饰的共价抑制剂发现。(A-B) LC3B蛋白的相互作用界面以及赖氨酸pKa性质预测。(C-E) 共价小分子库的筛选以及苗头化合物的发现。
  进一步,为了探索LC3B-化学探针分子相互作用,并为药物化学优化提供线索,团队解析了LC3B与DC-LC3in衍生物复合物的晶体结构(分辨率约1.6埃)。最终,通过药物化学优化,团队获得了活性更强的先导化合物DC-LC3in-D5 (IC50为0.2 μM)。为了详细评估共价化合物的潜在脱靶风险,团队利用点击化学-蛋白质质谱的方法,结合体内外实验验证,证明了DC-LC3in-D5在全细胞蛋白中存在选择性,主要结合LC3家族蛋白中的LC3A/B蛋白,存在较低的脱靶性质。
图2. 先导化合物DC-LC3in-D5具有良好选择性:(A) DC-LC3in-D5以及阴性分子DC-LC3in-D9;(B) 化合物具有良好动力学性质。(C-D) 化合物结合LC3B的K49残基,而不结合合成的LC3B肽段上的K49残基。 (E-G) 点击化学-质谱以及质谱结果验证。
  最后,细胞实验表明,DC-LC3in-D5可以抑制LC3B蛋白从LC3B-I向LC3B-II转变的脂酰化过程。并且,其可以缓解饥饿条件下P62蛋白的降解,减少自噬小体的数目,最终发挥抑制自噬的功能。
图3. DC-LC3in-D5抑制自噬。(A-B) DC-LC3in-D5抑制LC3B脂酰化而不影响GABARAP脂酰化,减少了P62的降解。(C-F) DC-LC3in-D5抑制自噬小体形成。
  综上所述,该研究工作发现了第一个共价结合LC3B K49的小分子抑制剂,通过破坏蛋白-蛋白相互作用发挥功能。此外,该研究靶向翻译后修饰位点,发现其共价抑制剂,可为常规策略化学分子难以靶向蛋白的小分子开发提供可借鉴的思路。
  
图4. LC3共价小分子作用模式示意图
  中国科学院上海药物研究所罗成研究员、复旦大学/重庆医科大学党永军教授、上海药物所周兵研究员、蒋华良院士为该论文的共同通讯作者;上海药物所博士研究生范仕杰、乐立艳博士、万伟博士、张元元副研究员、张碧东博士为该论文共同第一作者。该研究还得到了Scripps研究所Takanori Otomo教授,上海药物所陈凯先院士、谭敏佳研究员、张乃霞研究员的支持。研究得到国家自然科学基金生物大分子动态修饰重大科学计划、杰出青年基金和上海市科委等项目的资助。该项目相关专利已经转化至企业,开展全面的临床研究前研究。
参考文献:
1.Galluzzi, L., et al., Metabolic control of autophagy. Cell, 2014. 159(6): p. 1263-76.
2.Choi, A.M., S.W. Ryter, and B. Levine, Autophagy in human health and disease. N Engl J Med, 2013. 368(7): p. 651-62.
3.Galluzzi, L., et al., Pharmacological modulation of autophagy: therapeutic potential and persisting obstacles. Nat Rev Drug Discov, 2017. 16(7): p. 487-511.
4.Levine, B., N. Mizushima, and H.W. Virgin, Autophagy in immunity and inflammation. Nature, 2011. 469(7330): p. 323-35.
5.Menzies, F.M., A. Fleming, and D.C. Rubinsztein, Compromised autophagy and neurodegenerative diseases. Nat Rev Neurosci, 2015. 16(6): p. 345-57.
6.Whitmarsh-Everiss, T. and L. Laraia, Small molecule probes for targeting autophagy. Nature Chemical Biology, 2021. 17(6): p. 653-664.
7.Huang, R., et al., Deacetylation of nuclear LC3 drives autophagy initiation under starvation. Mol Cell, 2015. 57(3): p. 456-66.
8.Wilkinson, Deepti S., et al., Phosphorylation of LC3 by the Hippo Kinases STK3/STK4 Is Essential for Autophagy. Molecular Cell, 2015. 57(1): p. 55-68.
9.Nieto-Torres, J.L., et al., LC3B phosphorylation regulates FYCO1 binding and directional transport of autophagosomes. Curr Biol, 2021. 31(15): p. 3440-3449.e7.
  (供稿部门:罗成课题组)