2019年6月19日下午，中国科学院上海药物研究所“药学前沿承嘏讲坛”第二十三讲在承嘏厅举行。苏州大学医学部王志新院士和吴嘉炜教授应邀作了专题报告，标题分别为“PAK家族蛋白激酶的自激活机制”和“Protein kinase and phosphatase regulation”。上海药物所学术委员会主任蒋华良院士主持报告会，药物所百余位科研人员和研究生参加本次报告。

　　PAK家族蛋白激酶的自激活机制

　　王志新院士首先介绍了蛋白激酶自激活机制的研究背景。Ostwald于1890年提出了自催化概念，并将其定义为由自身产物催化的化学反应。自催化反应在复杂化学反应中广泛存在并非常重要，上世纪20-30年代在生物领域就发现了自催化，如酶原的自催化。蛋白磷酸化调控细胞内信号传导途径，非磷酸化下是无活性的，通常受上游酶的催化，蛋白才变成有活性的酶。上世纪40年代，已经发现蛋白的自磷酸化。以往的研究表明自磷酸化过程确实存在，并且酶的活性与酶浓度、时间有关，但自磷酸化过程很缓慢，可能无法与经典通路的磷酸化竞争。有报道称46%蛋白激酶可以发生自磷酸化（有待确证），但蛋白激酶的自磷酸化发生机制一直很不清楚。

　　p21-激活激酶（p21-activated kinases, PAKs）是一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，PAKs与许多底物参与一系列生理过程，在癌组织中是高表达的，但这一类激酶抑制剂在使用过程中容易产生抗药性。找到PAK家族自激活机制，就可以找到抑制PAKs 自激活的抑制剂，设法在PAKs 自激活前将其抑制，对设计特异性的别构抑制剂有着重要的意义。PAK一共有6个家族，被划分成Group I 和 Group II亚家族。PAK1、PAK2和PAK3 属于Group I，除了有一个保守的激酶结构域外，N端有一个调节结构域，非磷酸化下以自抑制状态存在，结合底物后打开自抑制，激酶结构域的活化环位点可以通过自磷酸化完全激活。

　　接下来，王院士的报告详细介绍了如何从酶动力学和结构生物学2个方面结合来研究PAK家族蛋白激酶的自激活机制。

　　首先，王志新院士以PAK2激酶结构域片段的蛋白（PAK2-KD）为例详细介绍了自激活过程的酶动力学机制研究。他们实验室发展了一种连续分光光度酶联分析法来测定蛋白激酶的活性，通过测定反应过程中酶的活性，间接研究磷酸化动态修饰过程，酶的活性则通过测定其与外源底物的反应得到。实验测定了加ATP后不同酶浓度下的PAK2-KD的自激活过程，和不同底物浓度下PAK2-KD的自激活过程，分析实验结果，和酶动力学预测基本吻合。最后得出结论：PAK2-KD对外源底物的催化活力与全长蛋白相当；催化外源底物的反应与分子间自磷酸化反应是竞争性的关系；磷酸化之前，近7%的非磷酸化PAK2-KD具有活性激酶构象，也可以起始自磷酸反应。

　　其次，王志新院士讲述了如何结合应用结构生物学方法研究PAK自磷酸化机制的分子基础。其实验室制备了磷酸化的PAK1-KDk278R 和 PAK2-KDk299R，在测定了它们的晶体结构以及它们与 ATP分子的复合物结构后，还首次得到一个非磷酸化状态下的 PAK1激酶结构域双体PAK1-KDk299R/D389N（KD-A/KD-B）的晶体，通过结构解析和与磷酸化的结构比对，该非磷酸化 PAK1 激酶结构域双体KD-A和KD-B呈现两种不同的构象：KD-A结合了ATP，与磷酸化后的活性构象相似，KD-B处于非活性构象。该结构展示了一种蛋白激酶分子间自磷酸化反应进行的可能模式，即非磷酸化的PAK1处于一个动态的构象平衡（近7%的非磷酸化PAK2-KD具有活性激酶构象），处于非活性构象的分子将其活化环伸入另一个处于活性构象的分子的活性中心，形成了一个分子间自磷酸过程中的“酶-底物”复合物，而王院士的团队幸运的得到了这一复合物的瞬态晶体结构，直观验证了之前的酶动力学假设。他们进一步解析了第二个非磷酸化的同源蛋白的单体晶体结构，结合酶动力学的分析，预测存在分子内的自磷酸化构象，更多工作还在进行中。王院士对PAK家族蛋白激酶的自激活机制的研究，是酶动力学和结构生物学相结合的成功范例。

　　Protein kinase and phosphatase regulation

　　首先，吴嘉炜教授介绍了其实验室主要采用分子酶学和生物化学方法、结构生物学（晶体学）方法，以及分子生物学和细胞生物学方法来研究与糖脂代谢相关的蛋白激酶和磷酸酶的结构和功能。随后，吴教授详细介绍了AMPK及复合物的结构和功能，阐述了AMPK及同源蛋白的别构调控是如何实现的。AMPK（Adenosine 5‘-monophosphate (AMP)-activated protein kinase）即AMP依赖的蛋白激酶，在能量代谢调控中起极其重要的作用。AMPK的结构区别于其它激酶最大的特别之处是它以三个不同的亚基相互作用而形成一个三聚体，其中α-亚基含有激酶结构域（Kinase domain, KD）和自抑制片段（Auto-inhibitory domain，AID）等。大部分蛋白激酶需要磷酸化才会变成活性的构象。同时，一些蛋白激酶也会通过其它调控蛋白来实现活性的变化。其实验室解析了包含激酶结构域和自抑制结构域的AMPK片段的空间结构，以及磷酸化的具有生物活性的AMPK激酶结构域的三维结构。通过分析蛋白激酶结构在磷酸化和非磷酸化下的构象变化，以及AID存在和突变时的构象变化，从结构上证明了AID通过调控AMPK激酶结构域KD构象（从Close，active变为Open，inacive）来抑制激酶活力。

　　AMPK三聚体又是如何感知细胞内ATP/AMP浓度变化的？研究组发现，AMPK三聚体活力随AMP浓度增加而增加，当AID结合界面被破坏时，AMPK对AMP的感知能力也被破坏，而且活力没有被抑制。由此提出了一个新的调控模型：当AMP结合到γ-亚基上，解除了自抑制结构域对激酶结构域的抑制。实验室获得AMP/ATP结合AMPK的共结晶晶体结构，通过分析它们的细微结构差别，以及相关实验阐明，γ-亚基上的结合位点3和4是对AMP结合AMPK起决定性作用的位点。

　　吴教授随后解释了AMP结合γ-亚基如何最终增强α-亚基的激酶活性。在相关实验基础上，其团队提出一个哺乳动物AMPK的别构调控机制： KD的抑制和激活取决于ATP/AMP结合下的构象变化，ATP/AMP的结合影响了α-RIMS的结合，继而影响AID的结合,导致KD的抑制和激活。AMPK是一个蛋白家族，同样的类似结构域，每个蛋白的相互作用的界面是不一样的，寻找别构调控的新位点，对特异性的激酶抑制剂的研发有着重要的意义。

　　接着，吴嘉炜教授介绍了免疫体系相关的MAPK信号转导通路方面的研究工作和最新进展。丝裂原活化蛋白激酶（Mitogen-Activated Protein Kinase，MAPK）是一组能被不同的细胞外刺激激活的丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶，是信号从细胞表面传导到细胞核内部的重要传递者，一系列免疫反应的调控都是这个家族的激酶和磷酸酶在调控。MAPK信号通路可以被细胞外刺激激活，其路径为：上游激活蛋白→MAP3K →MAP2K→MAPK，通过依次磷酸化将上游信号传递至下游应答分子。MAPKs是该蛋白激酶级联的最下层被激活的激酶，它们的完全激活需要活化环上的酪氨酸（Tyr，Y）、苏氨酸（Thr，T）的双磷酸化，这是MAPK不同于其它蛋白激酶的一个特点。根据被激活的MAPK种类和它们所识别的转录因子一般将MAPK信号通路分为ERK、JNK 和p38三类。以p38为例，其实验室通过解析双磷酸化p38α/pTpY的激酶结构，证实p38的完全激活需要其活化环上的酪氨酸和苏氨酸两个磷酸化位点同时被磷酸化，得到的这个双磷酸化结构与非磷酸化结构对比，磷酸化的T和αC有构象变化，调控形成的H键更多，构象稳定的因素更大。MAPK磷酸酶（MAP Kinase Phosphatases，MKPs）也是双特异性的，通过制备非磷酸化、双磷酸化（pTpY）、单磷酸化（pT、pY）的MAPK，分析其p38α活力，表明pT单磷酸化的活力约为双磷酸化的10%，而pY单磷酸化的活力与非磷酸化的活力相当，原因是pT单磷酸化形成更多氢键，更多稳定其活性构象。吴教授的实验室针对双特异性磷酸酶家族（MKPs）作了一系列工作。在人哺乳细胞中有十种类型的MKPs，都有一个共同的结构特征：它们都具有一个保守的催化结构域（Catalytic Domain, CD）N 端激酶结合结构域（Kinase Binding Domain, KBD），KBD上含有一个十几个氨基酸构成的激酶相互作用模体（Kinase Interaction Motifs/Docking Motifs, KIM, D-motif），存在于上游激酶和下游底物，参与介导上下通路调控。为了确证KBD结构域的精细结构和KIM结合位点，其实验室解析了MKP5-KBD-p38α复合物结构，以及10个MAPK家族蛋白中的大部分KBD结构域的晶体结构，更多工作还在进行中。

　　最后，吴教授介绍其实验室获得并解析了C-Jun氨基末端激酶JNK1与MKP7-CD的复合体晶体结构，通过分析该结构上特异性的催化调控，首次发现相互作用模体FXF通过识别F位点参与调控的机制，并进行了实验验证。同一家族的蛋白，即使序列同源性高达70%-80%，它们所参与、使用的分子调控机制也可能完全不同。吴教授实验室将进一步开展更细致的相关机制研究。

　　王志新院士的报告内容新颖、视角独特、逻辑严密、层次清晰。吴嘉炜教授的报告内容详实生动，条理清晰，引人入胜。会后，研究人员就蛋白激酶的相关问题同两位教授进行了热烈地探讨。蒋华良院士为王志新院士和吴嘉炜教授颁发讲坛纪念证书。

　　王志新现为苏州大学医学部教授，1997年当选中国科学院院士，1999年当选第三世界科学院院士。任第九、十、十一届中国人民政治协商会议全国委员会委员，第九、十届中国生物化学与分子生物学会理事长。曾获1990年中国科学院自然科学奖一等奖、1993年国家自然科学奖二等奖、第三届中国科学院青年科学家奖一等奖和第二届中国青年科学家奖等。

　　吴嘉炜现为苏州大学医学部教授。曾获得基金委杰出青年基金、科技部 973 项目、基金委重点项目等支持，在国际重要学术期刊上发表论文八十余篇。获“谈家桢生命科学创新奖”，入选“第八届中国青年女科学家”并受聘为“教育部长江学者特聘教授”。

　　本期讲坛由上海药物所主办、新药研究国家重点实验室和中科院受体结构与功能重点实验室联合承办。

王志新院士作主题报告

吴嘉炜教授作主题报告

报告会现场

　　（供稿部门：新药研究国家重点实验室；供稿人：丁宁、李川）