2025年6月27日，中国科学院上海药物研究所陆晓杰课题组联合赵玉军课题组和中国药科大学褚钱课题组，在DNA编码环肽库筛选与分析领域取得了重要进展。研究成果系统揭示了包含多种成环方法的环肽库不一样的筛选结果，并提出了不同的化合物挑选和验证方法。相关成果以“Influence of Macrocyclization Strategies on DNA-Encoded Cyclic Peptide Libraries”为题发表于国际学术期刊JACS Au。

环肽因其独特的空间结构和生物活性，近年来在口服药物、多肽偶联药物、诊断试剂等领域展现出巨大的应用潜力。然而，如何高效筛选并发现具有优异性质的新型环肽分子一直是药物研发领域的重要挑战。DNA编码化合物库技术（DNA-Encoded Library Technology, DELT）的快速发展，为环肽分子的高通量筛选提供了高效、便捷且经济的平台。DELT通过将特定的核酸标签与多肽分子连接，实现了大规模化合物库的快速构建和筛选，在引入各类非天然氨基酸和成环方法上具有先天的优势。

以往的研究多采用单一环化策略构建化合物库，对靶点蛋白进行筛选和验证。然而，这种单一策略往往存在假阳性风险，且可能遗漏部分高活性分子，限制了筛选结果的全面性和准确性。因此，研究团队充分利用DELT的合成灵活性，设计并快速合成了八个环肽子库。每个子库均采用相同的合成砌块组合，但最终通过不同的环化方法完成环肽骨架的构建。八个子库共同组成了一个包含约1亿种不同环肽分子的超大规模环肽库。团队以肿瘤相关蛋白MDM2和蛋白-蛋白相互作用调控因子GIT1为代表靶点，开展了系统的筛选与验证实验。

在MDM2的筛选中，研究发现多个子库展现出高度一致的富集模式，特定氨基酸序列的环肽在不同环化策略下均被富集。进一步的off-DNA合成及体外活性检测显示，这些序列相同但环化方式不同的环肽均表现出优异的靶点结合能力，其中最高结合活性（K_i）达11 nM。这一结果表明，跨子库的结构富集模式可以显著提升筛选苗头分子的可靠性。与此同时，团队还发现，部分在单一子库中富集度较低的环肽组合，经off-DNA合成后同样展现出良好活性。这一现象提示，单一子库筛选可能低估了部分高活性分子的潜力，强调了多子库交叉分析的重要性。

针对GIT1的筛选则呈现出另一种典型情形：不同子库间未观察到一致的富集模式。团队通过标准化流程筛选出的两个环肽化合物，进一步体内外验证发现，其中一个环肽能够特异性结合GIT1并有效阻断其与β-PIX的相互作用（K_i=1.22 μM），而另一个分子则未显示出阻断活性。通过热转移、等温滴定量热等多种生物物理方法结合突变体分析，研究团队明确了关键结合位点。这一结果表明，面对单一富集结果，可以结合竞争性筛选、体外实验等多种手段，综合验证筛选命中分子的真实性和特异性。

本研究展示了由多种成环方法构建的环肽库的两种筛选结果，强调了系统研究多组富集数据在挑选化合物中的关键作用。而对缺乏一致性的数据中，建议结合额外的竞争筛选和体外验证以多维度验证苗头化合物。

上海药物所研究生赵翰卿、中国药科大学研究生李雪为本论文的共同第一作者。上海药物所陆晓杰研究员、中国药科大学褚钱教授、上海药物所赵玉军研究员和苏州阿尔脉生物科技有限公司王璇博士为本论文的共同通讯作者。本研究得到了国家自然科学基金委和原创新药研究全国重点实验室的资助。

原文连接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacsau.5c00473

DNA编码环肽库的构建及其亲和筛选流程

（供稿部门：陆晓杰课题组）