Cell Res | 上海药物所合作发现科学界长期寻找的内质网阴离子通道

  内质网是细胞内重要的储存钙离子的细胞器,其通过膜上分布的三磷酸肌醇受体(IP3R)和兰尼碱受体(RyR)通道释放钙离子,并通过SERCA质子泵回收钙离子。钙离子跨内质网膜的流动带来电势的变化,需要其他离子进行电荷和渗透压的平衡。目前研究已证实内质网钾离子通道TRIC的存在,但一价的钾离子无法同时抵消二价钙离子释放产生的电势差和渗透压差,科学家因此推测内质网膜上必定同时存在一个阴离子通道。但该通道的神秘身份一直未被鉴定。
  2023年5月4日,清华大学医学院贾怡昌、中科院上海药物所高召兵与北医三院樊东升教授团队合作在Cell Research在线发表论文“Disruption of ER ion homeostasis maintained by an ER anion channel contributes to ALS-like pathologies”,首次证实了CLCC1是内质网定位的氯离子通道,具有协助内质网钙离子释放和调节内质网的离子稳态的生理功能;其功能缺失会破坏内质网的离子稳态,引发内质网胁迫并对肌萎缩侧索硬化症(ALS)的病理有贡献。该项研究揭开了科学界长期寻找的内质网氯离子通道神秘面纱。Cell Reseaerch同期发表评论性文章“Identity revealed for a long-sought ER anion channel”,其通讯作者迈阿密大学Laura Bianchi指出,该项研究发现了科学界长期以来寻找的内质网氯离子通道,并首次揭示其与肌萎缩侧索硬化症密切相关,可能是一个潜在的药物靶点。
  从全长序列看,CLCC1与已知Clic通道蛋白序列并无相似性,根据其内质网定位特征和电生理数据,研究人员建议将该基因重新命名为ER Anion Channel 1 (ERAC1)。为了研究CLCC1是否参与调节内质网的离子稳态,研究团队首先制备了内质网定位的比率型(ratiometric)氯离子探针和比率型钾离子探针。结合流式细胞术对293FT细胞进行检测发现,敲低CLCC1导致静息态[Cl-]ER和[K+]ER升高。透射电镜结果表明,不同于对照细胞中出现的细长且结合核糖体的内质网结构,CLCC1敲低的细胞出现更多的短棒状内质网,且内质网的平均宽度也会增加。因此,CLCC1维持着内质网中氯离子浓度和钾离子浓度,以及内质网的形态。
  在接下来的实验中,研究团队发现CLCC1功能缺失导致 [Ca2+]ER下降, 通过大量实验证明CLCC1对内质网钙离子释放是必要的。紧接着,研究团队发现磷脂酰肌醇PI(4,5)P2可以增加CLCC1的电导和开放概率,并揭示PIP2关键结合位点为K298。突变K298A降低通道功能及PIP2敏感性,而K298A敲入小鼠不仅在小脑出现内质网胁迫的信号和内质网膨胀的表型,而且脊髓中ChAT+运动神经元数量减少,并出现后腿无力的表型。在一个新的中国ALS病人队列中,研究团队发现了包括W267R和S263R在内的8个罕见突变。S263R和W267R经过单通道电生理,钙成像,基因敲入(knock-in)小鼠的病理学检测等一系列实验,证实为功能缺失的突变。K298A、S263R和W267R这三个knock-in小鼠品系内源CLCC1蛋白因更多的泛素化依赖的降解而出现表达量下降的特征,显示表型的严重程度依赖于CLCC1蛋白的表达量。在脊髓ChAT+运动神经元中条件性敲除CLCC1基因,小鼠出现内质网胁迫,泛素化蛋白聚集,TDP-43蛋白出核,运动神经元数量减少,和出生后一个月内快速死亡的表型。以上结果首次将CLCC1的突变与ALS联系起来,并暗示CLCC1可能是一个新的ALS致病基因。考虑到CLCC1同源多聚体的形成以及显性负效应(dominant negative effect)的存在,通过补充野生型CLCC1蛋白或者激活剩余的CLCC1的通道活性来治疗相应的疾病是一个可能的治疗手段。
  本研究在分子水平首次证实了CLCC1独立形成阴离子通道;在细胞层面提出阴离子通道调节内质网离子稳态的新假说:内质网腔的钙离子经过IP3R或者RyR通道释放到细胞质后,解除了对CLCC1的抑制,升高了内质网细胞质一侧的电势,驱动了氯离子经由CLCC1进入细胞质,同时TRIC释放钾离子进入内质网腔,从而达到电荷与渗透压的持续平衡。当CLCC1的功能缺失时,需要两倍于钙离子剂量的钾离子进入内质网来中和电势的短期变化,这升高了内质网腔的渗透压,导致内质网膨胀和内质网钙离子浓度的下降,激活了UPR;本研究使用多个CLCC1突变小鼠模型揭示了CLCC1表达剂量依赖的ALS发病新机制,支持了环境因素作用于遗传因素从而引起ALS的双重打击(two-hit)理论,为临床ALS疾病的治疗提供了新靶标和新思路。
  清华大学生科院/生命科学联合中心毕业生郭亮博士、上海药物所毛琼蕾博士和北京大学第三医院何及博士为论文的共同第一作者。清华大学医学院/生命科学联合中心贾怡昌教授、上海药物所高召兵研究员和北医三院樊东升教授为共同通讯作者。清华大学药学院肖百龙教授和刘晓玲博士,医学院朴学娇博士、罗莉博士、宋强博士,生科院本科生于涵之,上海药物所及浙江城市学院联合培养硕士生郝晓旭均有重要贡献。本工作获得了国家自然科学基金、北大-清华生命科学联合中心、IDG/麦戈文研究所和北京市科委等支持。
内质网定位的阴离子通道CLCC1/ERAC1调节内质网离子稳态
(供稿部门:高召兵课题组)